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徠卡冰凍超薄切片技術(shù)

更新時間:2013-05-15   點擊次數(shù):3874次

 徠卡冰凍超薄切片技術(shù)

 

 徠卡冰凍超薄切片技術(shù)是使樣品迅速冷凍,然后用冷凍切片機(jī)進(jìn)行徠卡冷凍超薄切片。它省去了普通超簿切片法中繁雜的化學(xué)固定與包埋操作,在細(xì)胞化學(xué)研究中有著特殊的用途。為了很好保存形態(tài)結(jié)構(gòu),必須使游離水形成玻璃態(tài)的冰,防止產(chǎn)生冰晶。這就要求很高的冰凍速率(~度/秒),這對于傳熱性能差的生物材料來說是困難的。一般除了盡可能地提高冷凍速率外,還可考慮采用盡可能小的樣品尺寸(小于1立方毫米),對樣品進(jìn)行冷凍保護(hù)處理等,但通常也只能在樣品表面幾微米到幾十微米范圍內(nèi)能達(dá)到玻璃態(tài)。更深層將會因冷凍速率低而產(chǎn)生冰晶損傷。

 
1、儀器準(zhǔn)備
 
進(jìn)行冷凍超薄切片必須使用專門的徠卡冷凍超薄切片機(jī)或配有徠卡冷凍超薄切片附件的普通超曲切片機(jī)。德國生產(chǎn)的LeciaCM3050S型和LeciaCM1950凍切片機(jī),可用于冷凍超薄切片。
 
2、醛類固定
 
戊二醛固定可良好保存結(jié)構(gòu)和生物大分子的活性,而且結(jié)合冷凍保護(hù)劑能有效防止冰品的產(chǎn)生。典型的固定液是:0.1M二甲胂酸鈉緩沖液(pH7.2)的2.5%戊二醛溶液,固定時間約1小時,固定溫度37℃。
 
3、包封
 
即用某些分子量較大的物質(zhì)將組織包埋起來,以便切出大面積平整的切片。這些物質(zhì)不滲入細(xì)胞內(nèi)部,只滲入細(xì)胞間隙,起臨時成形和支持作用。具體方法:將組織放在事先溶解好的20%的明膠溶液中保溫15—30分鐘,然后在冰箱中凝固,使樣品包封。也可以用甲基纖維索、牛血清蛋白等代替明膠,不進(jìn)行包封亦可以獲得較好的切片。
 
4、徠卡冷凍保護(hù)處理
 
在包封之后,將樣品放在30%~50%甘油中浸泡5~30分鐘,進(jìn)行冷凍保護(hù)處理。甘油效果較好,它不容易污染切片,具有濕潤作用,有利于切片。
 
5、徠卡快速冷凍
 
這是獲得高質(zhì)量冷凍切片的關(guān)鍵,常用的方法有三種:
 
①用液氮直接冷凍在樣品架上滴上一滴緩沖液,放上預(yù)處理過的樣品,一起直接放入液氮冷凍。這種方法如上述由于存在汽泡絕熱層,冷凍速率低,效果不佳。
 
②間接冷凍法采用某些低熔點,高沸點,高熱容量及傳熱好的中間冷媒,如:乙烷、異戊烷、丙烷、氟里昂等。將一金屬容器置于液氮中,再將中間冷媒注入容器中,待中間冷媒冷卻后,然后把樣品投入個間冷媒的容器中冷凍。由于這些冷媒不會沸騰和形成絕熱泡層,因此,冷凍速率高,效果較佳。
 
③金屑接觸冷凍法將一銅塊至于液氮中,待溫度平衡后,取出銅塊并將樣品與它接觸0.3~0.5秒,使樣品冷凍后,投入液氮中,繼續(xù)冷凍。此法出于樣品預(yù)先冷凍,樣品放入液統(tǒng)中不會產(chǎn)生絕熱的汽泡層,冷凍效果較好,特別適用于無溶液制備法。
 
6、切片
 
要進(jìn)行徠卡冰凍超薄切片首光必須熟練掌握普通徠卡常規(guī)超薄切片技術(shù)。在進(jìn)行切片之前要將樣品塊修整好。方法可用徠卡切片機(jī)修塊;也可在液氮中用一長柄刀片修整,但這兩種方法都不易掌握,效果不佳。較合適的方法是:將組織塊在戊二強(qiáng)固定的過程中,用刀片修整成適合于切片的梯形,并仔細(xì)放置在樣品架上進(jìn)行冷凍。
 
備注:徠卡冰凍超薄切片技術(shù)部分文章由北京中儀光科科技發(fā)展有限公司編輯整理上傳。
 

 

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